更新时间：2024-03-07 12:21
ds-cDNA是基因文库技术中，通过mRNA反转录所获得的cDNA（第一链），依靠DNA聚合酶，在一定条件下所延伸的与cDNA相互补的第二条cDNA链的英文简称。
ds-cDNA是基因文库技术中，通过mRNA反转录所获得的cDNA（第一链），依靠DNA聚合酶，在一定条件下所延伸的与cDNA相互补的第二条cDNA链的英文简称。
以下合成方法涵盖了ds-cDNA的基本合成手段，具体操作中往往由于实验条件和所用试剂的不同，进行适当调整。
cDNA的合成
（1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氢氧化汞1μl，室温反应l0分钟，使RNA变性。
（2）加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl，室温放置5分钟。β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用。
（3）向上述反应混合物加lmg/ml的引物01igo dT(12～18聚体)10μl，1mol/L Tris.HCl(pH8.3)5μl，11mol/L KCl7μl，250m mol/L MgCl22μl，再加20 m mol/L的4种dNTP各2.5μl，逆转录酶2μl（40单位），用水补充到50μl，充分混匀，42℃反应1～3小时。
（4）加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应，然后加150m mol/L NaOH 25μl，65℃反应1小时，或37℃8小时，水解mRNA模板，得到cDNA第一链，再加pH8.0，1m mol/L Tris.HCl，各25μl中和其pH。
（5）测定放射活性，计算合成的DNA量。实际上，cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%～30%。
（6）用等体积的酚-氯仿抽提―次，取水相并用SephadexG-100离心柱层析(参看第6章)将cDNA同剩余的dNTP分开，以2.5倍体积的95%冷乙醇沉淀。
（7）合成的cDNA第―链在1.4%的碱性琼脂糖凝胶上电泳，用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准，电泳后，铺X-光片，进行放射自显影，确定cDNA第一链的大小。
ds-cDNA的合成
（1）第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入
2.5×第二链缓冲液40μl，
DNA聚合酶Ⅰ23μ（或者T4-DNA聚合酶）
RNase H 0.8μ
加水至100μl
注：具体体系的配置，可依照实验用量和不同厂家的试剂酌情变更。
（2）14-16℃下放置2小时。(＞3Kb时反应时间延长至3-4小时)
（3）70℃，10min，点动离心,置于冰浴
（4） 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放置10分钟。
（5）加入4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后置于冰浴上.
（6） 等体积加入酚\u6c2f仿\u5f02戊醇抽上清,12000g，3min。
（7） 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V乙酸钠，-20℃30min沉淀,12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。
也可以选择试剂盒方法，如Promega的Universal RiboClone cDNA Synthesis System，里面就包含从RNA反转录成cDNA第一链，以及合成cDNA第二链所需的试剂。